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【昊文章】北京六院最新研究成果发现Paget's骨病新致病基因!

发稿时间:2021-04-02来源:亚博生物


    Paget’s骨病(PDB)是一种慢性进展性代谢骨病,以破骨细胞的异常激活为特征,导致骨吸收增加和代偿性骨形成、骨硬化。PDB能够影响骨骼的某个或多个区域,伴有多种临床表现,包括骨痛、骨骼和关节畸形、病理性骨折、耳鸣、听力下降以及视力丧失等。

骨肿瘤是PDB最严重的并发症,其中最常见类型为骨肉瘤,发生率为1%,其风险增加是普通人群的数千倍。其次还可并发纤维肉瘤、软骨肉瘤以及骨巨细胞瘤(Giant Cell Tumor,GCT),其中合并GCT非常罕见,并且这一疾病的发病机理仍不明确。

遗传是PDB发病的重要因素之一,报道发现SQSTM1、TNFRSF11A、TNFRSF11B、VCP、HNRNPA2B1等基因的突变与PDB相关。ZNF687曾被报道与意国南部几例PDB/GCT患者有关,然而,PDB和PDB/GCT的分子机制仍未完全解析,上述的已知基因只能解释其中一小部分病例。

课题组于2017年和去年分别收集到两个早发型PDB伴GCT(PDB/GCT)家系样本,其中家系一包含祖孙三代24位成员,10位成员以常染色体显性方式被诊断为PDB(图1,诊断资料详见原文),所有的患者呈现出PDB多骨侵犯(至少3个部位骨骼受累),并且发病年龄呈早发型。家系二包括母子两代4位成员,先证者和其母亲以常染色体显性方式被诊断为PDB(诊断资料详见原文)。这项研究同时纳入了30例PDB散发患者,这些患者均未检测出与PDB相关的已知基因突变。研究另外招募了570名健康汉族人群志愿者作为对照,检测健康人群中的突变频率。


    为了发现PDB/GCT的致病基因,研究人员对家系一15位成员进行连锁分析,并对患病的6位成员(II-2、II-4、II-5、II-9、III-4和III-9)进行全外显子组(WES)测序。多点参数连锁分析在染色体17:8、547-5、657和423的LOD分数最高,为2.70(图2A)。研究通过WES鉴定出73个功能变异,但只有2个在关键连锁区域内。进一步通过Sanger测序发现只有1个与疾病表型显示出精确的共分离:PFN1基因的c.318_321delTGAC杂合突变(p. Asp107Argfs*3),编码Profilin 1蛋白,该基因位于染色体17p13(图2B)。该突变位点4bp的缺失会导致一个提前终止密码子的移码突变,形成一个由108个氨基酸而不是140个残基组成的蛋白。研究人员又利用Sanger测序在1例散发患者中发现了PFN1基因的另一个相邻位置的缺失突变(图2B),c.324_324delG杂合突变(p.T109Rfs*2)。而在家系二成员(I-2)中鉴定到PFN1的c.335 T > C错义突变(p.Leu112Pro,图2B),这些研究结果表明PFN1的截短型突变和错义突变均是PDB/GCT的致病突变,而在健康对照中并未发现以上类型的突变。



    接下来研究人员在113例单纯GCT患者的肿瘤样本中分析PFN1基因是否存在体细胞突变,结果并未检测出PFN1体细胞突变存在。为了验证患者的破骨细胞是否具有典型的Pagetic破骨细胞特征,研究人员分别从健康对照和患者(家系一III-9)的外周血中分离出单个核细胞,并将其向破骨细胞诱导分化。正如预期,研究人员观察到PFN1突变的PDB患者破骨细胞数量及大小远高于对照组(图3)。



    为了研究PFN1突变在PDB发病机制中的功能,利用CRISPR-Cas9技术构建了Pfn1突变小鼠,Pfn1 c.318–321缺失纯合突变对于小鼠胚胎形成是致死的,Pfn1+/mut小鼠与野生型(WT)小鼠相比,突变小鼠从出生到成年,体型较野生型更小,体长和股骨长度缩短,颅面骨和脊柱表型明显差异(图4A)。MicoCT 3D重建显示与WT小鼠相比,Pfn1+/mut小鼠的颅缝较宽,颅面骨和脊柱后凸畸形(图4B)。另外,Pfn1+/mut小鼠骨小梁参数显示较WT骨量明显减少(图4C)。