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ob游戏微生物项目文章:红曲菌发酵的荞麦通过调节肝脏代谢物和肠道微生物来预防血脂异常和非酒精性脂肪肝

发稿时间:2020-12-08来源:ob游戏生物



红曲菌发酵米在中国和其他亚洲国家用于治疗消化系统疾病和促进血液循环已有几个世纪了。然而,红曲菌发酵荞麦(HQ)对非酒精性脂肪肝(NAFLD)和血脂异常的影响及其机制尚不清楚。口服红曲菌发酵荞麦(HQ)能显著抑制高脂高胆固醇饲料(HFD)小鼠体重和附睾白脂肪组织(eWAT)的异常生长,防止附睾脂肪细胞肥大,改善血清和肝脏与脂质代谢有关的生化指标。组织学分析还表明,添加HQ可显著减轻HFD喂养引起的肝脏脂质滴过多积聚。微生物组分析显示,添加HQ对喂饲HFD的小鼠肠道菌群结构有显著影响。Spearman相关分析显示,生理指标、血清和肝脏脂质谱与Bacteroidales S24-7StreptococcusAllobaculumClostridiales XIII呈正相关,但与LactobacillusRuminococcaceae_NK4A214 groupRuminiclostridiumAlistipes呈负相关。基于UPLC-QTOF/MS的肝脏代谢组学研究表明,HQ干预对初级胆汁酸生物合成、嘧啶代谢、乙醚脂质代谢、谷胱甘肽代谢、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢、氨基糖和核苷酸糖代谢等代谢途径具有显著的调控作用,HQ干预可调节肝脏脂质代谢和胆汁酸稳态相关基因的mRNA水平。总的来说,这些发现提供了新的证据,支持HQ通过调节HFD诱导的高脂血症小鼠的肠道微生物群和肝脏代谢物谱来改善血脂异常和NAFLD





红曲菌属包含三个著名的物种(M.purpureus、M.ruber和M.pilosus),它们通常用于大米发酵生产红曲米(RYR)。几个世纪以来,红曲米(RYR)一直被中国和其他国家视为具有促进循环作用的膳食补充剂和传统药物。随机安慰剂-对照研究已证明,膳食补充红曲米可显著降低低密度脂蛋白胆固醇(24%-27%)(LDL-c)和非高密度脂蛋白胆固醇(non-HDL-c)。一般来说,对于不能耐受其他降脂药物的患者,它是一种可接受的替代品。红曲菌可以利用底物产生大量的生物功能代谢产物,包括红曲色素、莫纳可林、γ-氨基丁酸、二聚体酸、酶、多糖、麦角甾醇、聚酮类、不饱和脂肪酸、植物甾醇、异黄酮、生物碱、微量元素等。另一方面,荞麦(Fagopyrum esculentum Moench.)含有多种黄酮类化合物、大量蛋白质、平衡氨基酸、纤维、维生素B1和B2、锌、铜、锰和硒。最近的研究表明,红曲发酵可以提高发酵基质中多酚或类黄酮的含量。例如,发酵后燕麦的酚类成分和抗氧化活性均显著提高。红曲菌GIM-3.592与酿酒酵母GIM-2.139共发酵可显著提高番石榴叶总多酚含量和抗氧化能力。另外,红曲菌发酵泰国糯米能降低饮食诱导的高胆固醇血症大鼠血液和肝脏胆固醇及脂肪肝变性的浓度。最近,Hong等人报道了红曲霉发酵的荞麦可以通过降低脂肪生成特异性基因表达并在G1 / S中期导致细胞周期停滞来抑制3T3-L1细胞的脂肪生成。然而,红曲霉发酵的普通荞麦(HQ)对体内血脂异常和NAFLD的改善作用和保护机制尚不清楚。越多的证据表明肠道微生物群参与了肥胖和肥胖相关并发症的发生,如血脂异常、NAFLD、胰岛素抵抗和T2DM。此外,肠和肝在代谢功能上有着内在的联系和强烈的相互依赖性。肠肝循环紊乱,包括肠道通透性增加和微生物紊乱,与血脂异常和NAFLD的发生密切相关。先前的一项研究发现,在非酒精性脂肪肝(NAFLD)中,由HFD喂养引起的肠道通透性和微生物紊乱可能导致代谢失衡和先天性免疫系统激活。近年来研究表明,荞麦的抗性淀粉能改善HFD诱导的高脂血症小鼠肠道微生物紊乱,特别是促进大肠杆菌、双歧杆菌、肠球菌和SCFAs的丰度,但抑制大肠杆菌的生长。但其对肝脏脂质代谢的改善作用及其与肠道菌群的关系尚需进一步探讨。随着代谢组学分析技术和先进软件的发展,UPLC-QTOF/MS以其较高的重现性、分辨率和灵敏度被证明适合于代谢组学研究,并在食品和营养研究领域得到越多的应用。以往的研究已经证明了UPLC-QTOF/MS在高脂血症相关血清代谢组学研究中的优势,发现血清中的脂肪酸、氨基酸、胆汁酸等代谢产物参与了高脂血症的发生。例如,基于UPLC-QTOF/MS的血清代谢组学研究表明,植物乳杆菌NCU116通过调节氨基酸、胆汁酸、脂肪酸和葡萄糖的代谢途径改善高脂血症。众所周知,NAFLD来源于肝细胞内不同种类的脂质的积累,这种积累是由过量的游离脂肪酸输送到肝脏、增加新生脂肪生成、减少脂肪酸β-氧化和胆汁酸(BAs)排泄所驱动的。迄今为止,红曲米(RYR)的大部分有益作用和药理特性已在体内外报道,但基于UPLC-QTOF/MS的肝脏代谢组学研究红曲菌发酵荞麦改善血脂异常和NAFLD的机制却鲜有报道。本研究旨在通过肠道微生物组的高通量测序和基于UPLC-QTOF/MS的肝脏代谢组学研究红曲菌发酵荞麦HQ对NAFLD伴血脂异常的保护作用及其机制。揭示了脂肪代谢表型与肠道菌群的关系,为开发抗高脂血症和NAFLD的功能性食品提供理论依据。



样品制备


在安徽农林大学食品生物技术实验室配制了红曲菌发酵的普通荞麦(HQ),详细步骤具体如下:用0.85%NaCl收获红曲孢子悬浮液(5×106个孢子),接种于250mL锥形瓶中,培养基中添加20g荞麦(调整初始含水量为46%v/w))、0.54%果糖、0.1%MgSO4·7H2O0.25%·KH2PO40.06%NHCl,在30℃培养10天。发酵结束后,将发酵产物干燥研磨成粉末,并在-20°C下储存。为了消除桔霉素,还对浸泡在去离子水(1:15g/mL)中的粉末进行轻微搅拌,同时在室温下将pH调至2.0,保持1h,并将残留物保持在-20°C以备进一步研究。用UPLC-QTOF/MSESI+)鉴定了红曲菌发酵荞麦70%乙醇提取物的主要生物活性成分(图S1和表S1)。

动物与饮食

40只无特异性病原体(SPF)雄性小鼠(6周龄)在标准环境(温度24±1℃,相对湿度55±5%,光/暗周期12h)中饲养,可自由获得食物和水。驯化1周后,将小鼠随机分为4组(n=8),共8周:(1 NFD组:给予正常脂肪饲料(NFD10%脂肪能量);(2HFD组:高脂高胆固醇饮食(HFD45%脂肪能量);(3HFD+Simv组:高脂高胆固醇饮食加辛伐他汀干预(15mg/kg/d);(4 HFD+HQ-L组:高脂高胆固醇饮食加低剂量红曲菌发酵荞麦干预(200mg/kg/d);(5HFD+HQ-H组:高脂高胆固醇饮食加高剂量红曲菌发酵荞麦干预(1000mg/kg/d)。实验期间,连续8周每周测量每只小鼠的体重(BW)。

样品收集

实验结束后,小鼠进行通宵禁食,将每只小鼠的新鲜粪便样本收集到2ml灭菌试管中,在液氮中速冻后于-80℃保存。通过眼睛或心脏采集血液,放入1.5ml离心管中,置于室温下1小时。采用颈椎脱位法处死小鼠,血清以3000转离心10min,于-80℃保存。立即切开附睾脂肪和肝脏,称重,用磷酸盐缓冲盐水(PBS)清洗,并在液氮中速冻并储存在-80°C

血清和肝脏样品的生化分析

血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)和肝脏中的TCTG水平由全自动生化分析仪测定。采用生化指标试剂盒测定肝脏总胆汁酸(TBAs)和非酯化脂肪酸(NEFA)水平。

组织病理学评价

新鲜附睾脂肪组织和肝脏标本在4%多聚甲醛中固定过夜,石蜡包埋,切成5μm厚的切片,用苏木精和伊红染色,用配有数码相机系统的光学显微镜在100200400倍放大率下观察。

粪便SCFAs和BAs的测定

8周后,将单独笼养鼠的新鲜粪便样本收集到2ml灭菌管中,并在-80℃下储存。使用毛细管气相色谱法对粪便样品中的SCFAs进行定量分析。使用商业试剂盒以酶法测定粪便中总胆汁酸(TBAs)的浓度。

基于UPLC-QTOF-MS的肝脏代谢组学研究

将肝脏样品(25 mg)和含有内标物(L-2-氯苯丙氨酸,2μg/mL)的提取液(乙腈:甲醇:水=2:2:1)(1000μL)混合,然后均质、超声和离心。上清液在真空浓缩器中于37℃下干燥。然后,将干燥样品在200μL 50%乙腈中重组并离心10分钟,上清液用于UPLC-MS/MS分析。原始UPLC-QTOF/MS数据由MassLynx 4.1处理。用VIP值和双尾t检验的p值(VIP>1.0p<0.05)筛选潜在的生物标志物。通过与Human Metabolome Database数据库(http://hmdb.ca/)比对,通过精确分子质量和MS/MS片段对生物标志物进行鉴定。肝脏生物标志物的路径分析在MetaboAnalyst网站上进行(http://www.metaboanalyst.ca/)

肠道微生物群高通量测序分析

用试剂盒提取粪便中总细菌DNA由北京ob游戏生物科技有限公司进行16S rRNA扩增子测序(V3-V4

qRT-PCR检测

RNAiso Plus试剂从保存的冷冻肝组织中提取总RNA,将每个样本的总RNA反转录为cDNA。按表1列出的引物进行qRT-PCR检测


HQ干预改善体重参数,减少脂肪堆积

在脂肪沉积方面,我们观察到脂肪沉积对小鼠体重的影响在任何一周的HFD小鼠中(+1.5%)和脂肪沉积(脂肪细胞)均无明显增加(p<0.01)。HQ干预降低了HFD喂养小鼠的体重增加(HQ-L:-13.19%HQ-H:-43.05%)和附睾脂肪堆积(HQ-L:-65.42%HQ-H:-63.66%),呈剂量依赖性(图1A)。高脂血症小鼠脂肪细胞直径明显大于其他实验组(图1B)。脂肪组织的扩张促进脂肪细胞功能紊乱和甘油三酯水解增加,这与甘油三酯和脂肪酸在肝脏中的积累密切相关。然而,HQ和辛伐他汀治疗使HFD小鼠附睾脂肪细胞的大小减小。与HFD组相比,HFD+SimvHFD+HQ-LHFD+HQ-H组小鼠的附睾脂肪细胞较小(图1B)。

HQ干预对血清生化指标的影响

为了确定HQ在改善HFD喂养小鼠脂质积聚方面的潜在作用,我们测定了喂养8周的小鼠血清TGTCLDL-cHDL-c(图1C)、ALTAST(图S2)水平。与NFD组相比, 8周后HFD组小鼠血清TC+49.34%)、LDL-C+48.42%)、ALT+108.74%)和AST+54.78%)水平明显升高(p<0.01,而HFD组小鼠血清TGHDL-c水平与NFD组比较无显著性差异(p>0.05)。辛伐他汀干预后HFD小鼠血清ALT-34.98%)和AST-21.46%)发生明显变化。此外,补充HQ可降低HFD喂养小鼠血清TCHQ-L:-19.91%HQ-H:-20.82%),TGHQ-L:-20.38%HQ-H-8.58%),LDL-cHQ-L:-20.25%HQ-H:-28.10%),ALTHQ-L:-11.21%HQ-H:-44.58%),ASTHQ-L:-16.79%HQ-H:-31.33%),但是增加了HDL-c水平(HQ-L:-13.88%HQ-H:-23.44%)。


HQ干预对肝脏生化指标及组织病理学的影响

如图2A所示,HFD组小鼠肝脏中TC+151.07%)、TG+404.05%)、TBA+57.79%)和NEFA+146.10%)水平更高。与HFD组小鼠相比,辛伐他汀(15mg/kg/d)组小鼠肝TG-64.80%)、TBA-35.77%)和NEFA-58.74%)水平较低。低剂量HQ干预(200mg/kg/d)可显著降低肝TG-50.76%)和NEFA-42.77%)水平,而高剂量HQ干预(1000mg/kg/d)可显著降低肝TC-51.24%)、TG-43.04%)、TBA-31.87%)和NEFA-50.11%)水平,呈剂量依赖性。脂滴是观察肝内三酰甘油积累的重要标志之一。通过H&E染色对肝脏的组织学分析表明,HFD喂养的小鼠在8周处理后表现为大泡性脂肪变性和肝细胞中央静脉周围大量炎性细胞浸润(图2B)。然而,辛伐他汀和HQ干预可显著减轻HFD诱导的小鼠肝脏脂质过多积聚,提示辛伐他汀和HQ均能有效抑制HFD诱导的高脂血症小鼠肝脏脂质积聚,防止脂肪肝的形成。



HQ干预对HFD小鼠粪便SCFAsBAs水平的影响

辛伐他汀和HQHFD喂养小鼠粪便SCFAs(包括乙酸、丙酸和丁酸)和BAs水平的影响如图3所示。与NFD组相比,HFD组小鼠粪便中总SCFAs、乙酸和丙酸水平显著降低(p<0.05)。补充辛伐他汀和HQ可部分改善HFD所致的不良反应。高剂量HQ干预(1000mg/kg/d)可显著提高粪便中SCFAs总量(p<0.05)、乙酸(p<0.01)、丙酸(p<0.05)和丁酸(p<0.01),而低剂量HQ干预(200mg/kg/天)仅显著提高粪便中乙酸水平(p<0.05)。同时,辛伐他汀和高剂量HQ干预(1000mg/kg/d)均能显著提高HFD组小鼠的粪便BAs水平(p<0.05),说明辛伐他汀和HQ干预可促进BAs通过粪便的排泄。